复旦大学张凡团队：再发Nature Materials!
7月29日，张凡教授团队再发Nature Materials，报道了一种基于铒(III)-菌绿素复合物的荧光团系统用于多路复用生物医学成像，下面进行详细介绍。
▲第一作者：Ting Wang, Shangfeng Wang , Zhiyong Liu
通讯作者：Shangfeng Wang，Weian Zhang，Fan Zhang
通讯单位：Fudan University，East China University of Science and Technology
DOI: 10.1038/s41563-021-01063-7
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背景介绍
荧光多路复用对生物和生物医学研究至关重要，其通过使用光谱不同的荧光团，可在一个样本中同时显示多种生物物种。然而，在活体哺乳动物中的荧光复用仍然是一个重大的科学挑战。研究表明近红外二区（NIR-II；1000-1700 nm）可以提供更佳的清晰度和更深的组织穿透。但是，许多已报道的NIR-II荧光团具有与可见光探针相同的光谱重叠问题。
02
本文亮点
◆ 本文报道了一种基于铒(III)-菌绿素复合物的荧光团系统，其具有较大的斯托克斯位移（>750 nm）和窄带NIR-NIR下转换光谱（半峰全宽≤32 nm）。
◆ 从细菌氯素三线态到铒(III)4I13/2能级的快速(2×109 s-1)能量转移克服了振动泛调猝灭的问题，在水中产生明亮和长寿命(1.73 μs) 1530 nm的发光。
◆ 通过活体小鼠动态循环和代谢过程的可视化和颅骨追踪小鼠脑内癌细胞转移，证明了复合物的激发/发射多路复用能力。
◆ 这种混合探针系统有助于高对比度和空间分辨率的NIR多路近红外成像，可广泛应用于荧光引导的手术、诊断和活体显微镜。
03
图文解析
分子设计和光物理性质
为了解决这个问题，作者将注意力转向了分子镧系Er(III)配合物，配体敏化可以在~1500 nm处产生大的Stokes位移，以金属为中心的单色发光(图1a)。作者利用五氟苯基细菌氯（TFPBC）获得分子配合物EB766。通过质谱和x射线衍射分析成功地鉴定了该配合物(图1c)。EB766在760 nm处激发，在1530 nm处产生强烈的单色发光(图1d)。
▲图1、EB766的发光原理、晶体结构和光谱特性。a、Er（III）络合物发光增敏的简化图：配体吸收，随后是能量转移和金属中心发射。EB766的化学结构（b）和X射线晶体结构（c）。d、TFPBC和EB766在DCM（左）中的吸收光谱以及10μM EB766在DCM和PBS（pH 7.4）中在760nm激发下在1400-1700nm范围内的发射光谱（右）。e，在1530 nm处测量的发光衰减曲线。
光激发动力学和敏化机理
为了建立TFPBC到Er（III）能量转移的机制和激发态动力学，对EB766及其Gd（III）类似物GB762进行了瞬态吸收（TA）实验。图2的结果表明，细菌氯素-铒配合物具有创建NIR-II分子工具箱的强大平台的能力。
▲图2 GB762 (a)和EB766 (b)在脱氧DMF中的飞秒TA等高线图。c，对飞秒TA原始数据进行全局分析，得到GB762和EB766的归一化DADS谱。d, GB762在2-甲基四氢呋喃中的归一化荧光(298 K)和磷光(77 K)光谱，与Er(III)三氟乙酸酯在DMSO中的归一化吸收光谱重叠。e，Jablonski图显示了主要的敏化路线(红线)。f, EB742的化学结构。g, EB742和TFPBC的菌氯配体的三线态能级。h,EB742和EB766在DCM中的吸收光谱和发光光谱。
全身光谱清晰多路成像
作者接下来评估EB766在体内光学成像的能力。图2的结果表明EB766活体荧光成像可以清晰地勾勒出脑血管结构和间隔紧密的股动脉、静脉。EB766独特的光谱特性可实现基于波长的稳健激发或发射多路复用。
▲图3 a, EB766磷脂胶束(绿色)和磷脂包裹NaYF4:20% Yb, 2% Er@NaYF4 (DCNP，紫色)在水中的归一化吸收和发射光谱。b，小鼠循环系统双色成像示意图。c，分别用EB766和DCNP标记小鼠颈部淋巴结构和血管，叠加图像。d, c中沿白虚线的截面强度剖面。小鼠后肢淋巴结构(EB766;e,g)和血管(DCNP;E,h)在鼠标的不同区域，以及它们的叠加图像(E,i)。f, e中沿白虚线的截面强度剖面。j, EB766磷脂胶束(绿色)和Cy7.5磷脂胶束(红色，发射尾)在水中的归一化吸收和发射光谱。k，小鼠代谢系统双色成像方案示意图。l，一段时间内显示肝脏和脾脏(Cy7.5)和胃肠道(EB766)的覆盖图像。
癌症转移的多重显微追踪
近红外光谱得益于低的组织散射和光毒性，允许深度穿透和相对高的激发通量而不损伤组织。作者推断，EB766的光谱优势将允许通过近红外表观荧光方法可视化体内的细胞动力学，与常用的多光子显微镜相比，该方法可能具有对比性、速率和穿透深度。图4的结果与先前通过活体双光子成像获得的结果非常一致，从而为在体细胞动力学研究提供了一种成本更低、创伤更小的方法。
▲图4、a，显示CT1530探针制备和肿瘤转移活体追踪方案的示意图。b, CT1530在PBS (pH 7.4)中的吸收、荧光和发光光谱。c, CT1530标记的人骨肉瘤143B细胞在760 nm激发下，900-1000 nm(红色)和1400-1600 nm(绿色)通道下的荧光图像，叠加图像(黄色)。d，图中显示在硬脑膜以下四种不同深度(0.8、1.2、1.6和2.0 mm)注射ct1530标记的143B细胞，随后活体显微镜观察。e, 760 nm激发下两个通道(Ch1, Ch2)四个不同深度对应的荧光图像。f，心脏内注射ct1530标记的细胞和cy7.5标记的磷脂胶束，然后通过颅骨活体显微镜观察。g, ct1530标记的143B细胞(红色)和cy7.5标记的血管(绿色)的代表性图像。
