浙大最新《Nature》文章！
▲第一作者：董金润，卢禹先
通讯作者：冯建东
通讯单位：浙江大学
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03715-9
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背景介绍
一般而言，化学反应往往是以单个分子转化为产物的方式来概念描述的，但通常是在探索集合平均行为的实验中观察到。观察、操纵和测量最为微观的单分子化学反应是科学家面临的一个长久科学挑战。
如果你想欣赏银河系的所有壮丽景色，最完美的方式应该选择一个没有月光的，远离城市带来的光污染的夜晚。相同的原理适用于显微镜，从宏观到围观：在完全黑暗的情况下观察微弱的物体要容易得多。本工作在直接光学成像方法中使用这种简单但强大的想法，利用化学发光反应，涉及在电极上电化学产生的钌络合物，屏蔽激光等光源的信号干扰，对溶液中单个化学反应事件产生的单光子进行成像。作者的方法在概念上不同于传统单分子显微镜中使用的基于荧光的方法，该方法因为导致光子发射的激发过程受电化学和化学反应性控制，不需要光照射就可以实现单分子反应的可视化观测。通过直接捕获单个反应的电化学发光的单光子，并开发超分辨率电化学发光显微镜，能够以高时空分辨率对活细胞的粘附动力学进行成像。该工作将促进对电化学反应的基本理解，同时，也被证明在生物测定和细胞成像有着重要且深远影响。
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本文亮点
- 本工作通过联用自制的具有皮安水平电流检出能力的电化学测量系统以及宽场超分辨光学显微镜，搭建了一套高效的电致化学发光控制、测量和成像系统。首次实现了单分子电致化学发光信号的宽场空间成像。
- 许多作者报告了单个纳米级或微米级物体的单分子钌基电化学发光（ECL） 成像，但目前仍未单个分子的ECL成像被报道。本工作创新性的利用在电极上电化学生成的钌配合物的化学发光反应，保证了最小的背景信号。
- 本工作发明了一种直接可以对水溶液中单分子化学反应进行成像的显微镜技术，并实现了超高时空分辨成像。
03
图文解析
▲图1. 组合宽场光学成像和电化学记录装置的示意图
要点：
1、从循环伏安法和 ECL 强度数据揭示了钌配合物的电化学反应过程作为电压的函数看出，发光信号及其发射光谱在618nm（2 eV）处有一个峰值，表明收集到的光子是由ECL反应产生的。
2、在1.4V的作用下，单个像元上记录的光子强度表现出随机通断行为，是单个分子反应的典型特征。电压的可逆切换表明，随机光信号受电压的控制。
3、基于光信号的可逆性、与电化学电流的良好同步性、发射光谱以及光子数与反应机理的对应关系，作者将离散光子信号归结为单个ECL反应。
▲图2. 图像模式（左）和光子计数（右）表征
▲图3.单分子ECL反应的动力学分析
要点：
1、由于快速的相机记录和反应物在溶液中的稀释确保反应有足够的时间和空间分离，作者能够观察到个别的反应。
2、钌基电化学反应可以是动力学控制或扩散控制。本工作通过分析相邻两个事件间的间隔时间( τoff )得到动力学信息。在发射光子之前，Ru (bpy)32+首先扩散到电极表面，然后开始反应。因此，反应物的浓度对实现单分子观测具有关键作用，观测事件与钌络合物浓度成反比的间隔时间和每帧图像观测事件数与浓度成线性关系。
▲图4. ITO表面结构的单分子ECL成像
要点：
1、凭借光学检测单分子反应并对其空间位置成像的能力，作者将定位显微镜的基本原理应用于ECL反应位点映射。
2、ITO表面上的反应位点经溶液中Ru(bpy)32+分子的靶向扩散，因此在重复单分子碰撞后积累了大量的ECL反应定位。该过程积累提高了单个反应位点的定位精度。
3、本工作对同一样品进行了单分子ECL反应表征。尽管单个反应的定位精度较低，但同一反应位点的重复碰撞会导致多个定位簇，从而能够重建ITO表面图像采集时间为115秒。扫描电子显微镜显示的空间模式与超分辨率以及ECL 图像之间的相关性非常好，从而验证了该方法。
4、在激发的Ru(bpy)32+的长寿命期间（在25 °C水中约0.64 μs），它可以在发射光子之前从反应位点扩散约20 nm，因此检测位点可能与反应位点不同。
▲图5. 活细胞的单分子ECL成像
要点：
1、ECL显微镜已被证明不需要直接标记用于细胞成像，但其分辨率太有限，无法访问更详细的粘合结构。当用单分子ECL直接在ITO表面成像单个细胞时，细胞的粘着区域阻止了ECL反应物向ITO表面反应位点的扩散。
2、作者以细胞的基质黏附为对象，对其进行单分子电致化学发光成像，观察其随时间的动态变化。成像结果与荧光超分辨成像可以进行关联成像对比，定量上表现出可以同荧光超分辨显微镜相媲美的空间分辨率，同时该技术避免了激光和细胞标记的使用。
3、作者通过随时间对光子成像，产生电极表面的图像。在细胞附着的区域不会产生光子，从而产生细胞的负像，空间分辨率可以达到22 nm。
4、单光子已成功被本工作捕捉成像，但很难将ECL反应期间从试剂转移到电极的每个电子都与检测到的光子明确相关。因此，单电子事件的检测和定位仍然是电化学中的一个具有挑战性的目标，需要设计出适合商业化的基于ECL的单光子显微镜。
