施一公团队，发24年最新一篇论文

2024年2月21日，清华大学/西湖大学施一公团队在PNAS 在线发表题为“Dark and Dronc activation in Drosophila melanogaster”的研究论文，该研究报道了一个自抑制的Dark单体和一个单层的多聚体Dark/Dronc复合物的冷冻电镜结构。生化分析表明自动抑制的Dark在与Dronc结合时发生寡聚，这足以激活Dark和Dronc。相反，先前观察到的双环DARK细胞凋亡可能代表一种非功能性或“通路外”构象。这些发现扩大了对果蝇细胞凋亡分子机制的认识。

2024年2月12日，堪萨斯大学Michael S. Wolfe及清华大学/西湖大学施一公等多团队合作在Cell Reports 在线发表题为“Familial Alzheimer mutations stabilize synaptotoxic γ-secretase-substrate complexes”的研究论文，该研究发现FAD突变破坏了γ-分泌酶在APP底物C99多步骤加工中的初始蛋白水解事件。冷冻电子显微镜显示，在过渡状态下，底物模拟物捕获了γ-分泌酶，这种结构与分子动力学模拟捕获的活化酶-底物复合物一致。在硅模拟和在纤维素荧光显微镜支持稳定酶-底物复合物的FAD突变。秀丽隐杆线虫中C99和/或早老素-1的神经元表达仅在FAD突变的转基因中导致突触丢失。设计的稳定酶-底物复合物和阻断Aβ产生的突变同样导致突触丧失。总的来说，这些发现暗示了在FAD发病机制中，γ-分泌酶裂解底物的停滞过程，而不是产物。

细胞凋亡在后生动物中是必不可少的。保守的细胞凋亡调控途径已经在一些模式生物中被描述出来，包括秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇和哺乳动物。一般来说，细胞凋亡的发生涉及启动物和效应物caspases的级联蛋白水解激活。启动物caspases的自催化激活需要一个多聚体的adaptor复合物。通常被称为凋亡体。效应半胱天冬酶通过启动物半胱天冬酶的直接蛋白水解裂解被激活。

在黑腹果蝇中，启动物caspase Dronc被果蝇凋亡抑制剂(DIAP)介导的泛素化抑制。在凋亡刺激下，DIAP被促凋亡蛋白Reaper、Hid和Grim (RHG)拮抗。通过各自的caspase募集域(CARDs)之间的保守相互作用，在Dark的促进下，Dronc经历了自催化裂解。与哺乳动物启动物caspase-9不同，caspase-9仍然与Apaf-1凋亡体相关，作为全酶发挥作用，激活的Dronc与Dark凋亡体分离，并自主切割下游效应caspase DrICE。

自抑制Dark (D333A)单体的冷冻电镜结构（图源自PNAS ）

在非凋亡条件下，Dark作为一种自抑制单体存在。与哺乳动物同源蛋白Apaf-1不同，它需要dATP和细胞色素c (Cyt c)进行寡聚，而Dark激活不依赖于Cyt c。在dATP存在的情况下，16个Dark原体组装成一个双环复合物，这是Dark凋亡体的冷冻电镜结构所揭示的。体外生化研究表明，即使在没有外源核苷酸的情况下，Dronc-CARD或全长(FL) Dronc酶原也足以诱导暗寡聚化以激活Dronc。

有趣的是，Dark与Dronc-CARD结合的复合体也以双环的形式存在，16个CARD被两个Dark环夹在中间，每个圆环包含8个Dark原体。此外，据报道，在激活后，Dark和Dronc形成了一个单一的环，尽管其结构仍有待阐明。尽管取得了这些进展，但Dark和Dronc被激活的分子机制仍然知之甚少。特别是，Dark和Dark/Dronc-CARD双环的功能尚不清楚。

Dark的工作模型促进了Dronc的激活（图源自PNAS ）

为了解决这些问题，该研究解决了自动抑制的Dark的结构，并推断其与低聚物Dark的比较可以解释在Dronc-CARD或FL-Dronc存在时dATP对于Dark寡聚化的可调性。研究人员还测定了FL-Dronc存在下的Dark的结构，以了解Dark促进Dronc激活的分子基础。

通过结构分析，该研究发现与Dark寡聚化相关的构象变化与Apaf-1相似。Dark在FL-Dronc的存在下组装成一个未密封的环，很像螺旋。生化研究表明，先前表征的双环Dark细胞凋亡可能代表一种通路外状态。Dark和Dronc之间的相互作用本身就足以激活两种蛋白质。这些发现既证明了进化保守，也证明了不同生物体中细胞凋亡的关键偏差。

论文信息：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2312784121